亲和层析填料的纯化介质及其作用原理

　　亲和层析填料是一种利用固定相的结合特性来分离分子的色谱方法。亲和色谱在凝胶过滤色谱柱上连接与待分离的物质有一定结合能力的分子，并且这种结合是可逆的，在改变流动相条件时二者还能相互分离。亲和色谱可以用来从混合物中纯化或浓缩某一分子，也可以用来去除或减少混合物中某一分子的含量。
亲和色谱具有高选择性，而且能有效地保持生物大分子高级结构的稳定性，同时还具有对活性样品高回收率的特点，所以亲和色谱可以用来从细胞提取物中分离纯化核酸、蛋白质，还可以从血浆中分离抗体。分离重组蛋白就经常使用亲和色谱。
亲和层析填料的纯化介质及其作用原理：
1.Ni柱纯化
Ni柱中的镍可以与有6个组氨酸标签的碱性蛋白结合
Ni-纯化介质是Ni离子金属螯合介质，Ni柱中的螯合的Ni可以与咪唑竞争性结合
Ni亲和层析柱可分为——Ni-IDA和Ni-NTA。Ni-IDA螯合了三价，Ni-NTA螯合了四价，所以IDA的载量要NTA比的高。IDA与蛋白结合能力较弱，载量相对较高，稳定性较差，Ni易脱落。而NTA的颗粒粒度均匀，粒径更小，并且螯合镍更稳定，能耐受较高的还原剂，使填料更加稳定，特异性较高。
2.GST亲和层析介质（GSTAgarose）
是用于纯化谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白，其谷胱甘肽转移酶与谷胱甘肽有亲和作用蛋白的分离介质，一步分离就可得到高纯度的GST融合目标蛋白，纯化条件温和，可以保证蛋白的活性。
3.麦芽糖结合蛋白(MBP)
有42.5KD大小，不含Cys，作为融合蛋白的标签，通常放在N端在大肠杆菌中进行表达。MBP能促进融合蛋白的可溶性表达，尤其对于难表达的真核细胞蛋白，膜蛋白病毒蛋白有很好的促溶表达能力，MBP融合蛋白的纯化在生理条件下进行，使用麦芽糖进行温和洗脱。保护了MBP标签蛋白的活性。标签在纯化后期需要用酶切去除，常用的内切酶是FactorXa，麦芽糖酶和肠激酶。
4.ProteinA亲和层析介质
常用于纯化和分离IgG。ProteinA是一种分离自金黄色葡萄球菌的细胞壁蛋白，主要通过Fc片段结合哺乳动物IgG。天然ProteinA有5个IgG结合域和许多其它的未知功能域。重组ProteinA包含5个高IgG结合域，并去除了其它非主要结合域以降低非特异性结合。
ProteinA亲和层析介质已经广泛用于从生物流体或细胞培液中分离纯化各种类型的IgG或者IgG片段。实验已经证明，ProteinA和IgG的相互作用仅涉及Fc区域，而不影响Fab片段和抗原的结合
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